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　　2、检测铁皮石斛的核酸组 合、 试剂盒以及方法， 涉及分子生物学技术领域。 本发明公开的检测铁皮石斛的核酸组合SEQID NO.1-2所示的内引物组和SEQIDNO.3-4所示的 外引物组。 该核酸组合通过LAMP技术可快速、 特 异、 灵敏、 简便的检测出铁皮石斛。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 107385048 A 2017.11.24 CN 107385048 A 1.一种检测铁皮石斛的核酸组合， 其特征在于， 其包括SEQ ID NO.1-2所示的内引物组 和SEQ ID NO.3-4所示的外引物组。 2.权利要求1所述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。 3.权。

　　3、利要求1所述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。 4.一种检测铁皮石斛的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1所述的核酸组合。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括： 用于等温扩增反应 的缓冲液、 dNTPs、 mg2+、 链置换DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光染料中的任意一 种或至少二种的组合。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光染料为SYBR Green I。 7.一种检测铁皮石斛的方法， 其特征在于， 其包括： 采用权利要求1所述的核酸组合对 待测样品进行LAMP反应。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征。

　　4、在于， 所述LAMP反应的反应体系包括： 所述核酸 组合、 用于等温扩增反应的缓冲液、 dNTPs、 mg2+、 DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧 光染料。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 在所述反应体系中， 所述核酸组合的外引 物组与内引物组的摩尔比为(7.8-8.2):1。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特征在于， 所述LAMP反应的条件为： 60-66恒温 孵育35-45min； 94-96灭活2-3min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107385048 A 2 一种检测铁皮石斛的核酸组合、 试剂盒以及方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生。

　　5、物学技术领域， 具体而言， 涉及一种检测铁皮石斛的核酸组合、 试剂盒以及方法。 背景技术 0002 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属兰科石斛属， 俗称铁皮 兰、 黑节草， 是我国传统名贵中药。 现代药理研究表明， 铁皮石斛具有抗肿瘤、 抗衰老、 增强 机体免疫力、 扩张血管及抗血小板凝集等作用， 因此在临床中被广泛应用。 铁皮石斛是中国 药典记录加工枫斗的唯一来源， 是石斛类药材中一个较为著名的商品， 常被视为价格昂贵 的极品。 在 中华人民共和国药典 2015年版中更是被单独分列出来。 但目前市场上流通的 商品铁皮石斛中混杂较多， 民间用。

　　6、于枫斗加工的材料也是五花八门。 市场上有30余种石斛 属及部分石仙桃属、 金石斛属和石豆兰属植物在市场上冒充铁皮石斛和其它药用石斛。 对 于石斛干品而言， 加工后的干品外形非常相似， 依靠经典的鉴定方法则更难鉴别。 此外， 来 源不同的铁皮石斛在化学成分上也有较大差异， 严重影响了商品铁皮石斛质量的稳定性。 0003 近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如DNA条形码、 位点特异性PCR等尽 管克服了传统鉴别方法准确度不高、 主观性大等缺点， 在实验室条件下实现了铁皮石斛的 准确检测， 但是由于常规PCR需要昂贵的PCR仪或测序仪以及凝胶电泳以及成像系统等， 大 大限制了这些检测方法的推广。

　　7、应用。 因此， 建立适用于铁皮石斛的准确、 快速、 低成本的检 测方法一直是中药鉴定领域中亟待解决的问题。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种检测铁皮石斛的核酸组合， 该核酸组合可快速、 特异、 灵敏、 简便的鉴别铁皮石斛线 本发明的另一目的在于提供上述核酸组合的应用。 0006 本发明的另一目的在于提供一种检测铁皮石斛的试剂盒。 0007 本发明的另一目的在于提供一种检测铁皮石斛的方法， 该方法可实现在药市、 药 房、 产地等快速、 特异、 灵敏、 简便的鉴别出铁皮石斛线 本发明是这样实现的： 0009 一种检测铁皮石斛的核酸组合， 其包括SEQ 。

　　8、ID NO.1-2所示的内引物组和SEQ ID NO.3-4所示的外引物组。 0010 上述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。 0011 上述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。 0012 一种检测铁皮石斛的试剂盒， 其包括上述的核酸组合。 0013 一种检测铁皮石斛的方法， 其包括： 采用上述的核酸组合对待测样品进行LAMP反 应。 0014 本发明具有以下有益效果： 说明书 1/6 页 3 CN 107385048 A 3 0015 本发明的提供的核酸组合， 其包括SEQ ID NO.1-2所示的内引物组和SEQ ID NO.3-4所示的外引物组。 该核酸组合通过LAMP技术。

　　9、可快速、 特异、 灵敏、 简便的检测出铁皮 石斛； 相应地， 本发明提供的检测铁皮石斛的方法， 具有以下优点： 0016 (1)检测时间短， 仅40分钟即可获得检测结果， 比现有的分子生物学检测方法缩短 2-3小时。 0017 (2)对仪器设备要求低， 不需要普通PCR所用的PCR仪、 电泳槽及凝胶成像系统， 只 要一个水浴锅即可完成检测反应， 可实现现场检测。 0018 (3)操作简单， 整个过程不涉及复杂的仪器设备， 检测结果清晰， 只用肉眼在日光 下观察观察颜色即可判断。 附图说明 0019 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当。

　　10、理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 范围的限定， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。 0020 图1为本发明实施例3提供的采用实施例1提供的核酸组合检测不同品种石斛的结 果； 0021 图2为本发明实施例4提供的对实施例1提供的核酸组合的特异性验证结果。 具体实施方式 0022 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、 完整地描述。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建 议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通。

　　11、过市售购买获得的常规产 品。 0023 下面对本发明实施例的一种检测铁皮石斛的核酸组合、 试剂盒以及方法进行具体 说明。 0024 以环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)技术为代 表的核酸等温扩增技术的问世， 解决了核酸分子标记鉴别方法上的诸多难题， 使其作为快 速鉴定成为可能。 LAMP是一种快速的核酸扩增技术， 利用特异引物及链置换DNA聚合酶在恒 温条件下自循环几十分钟， 就可完成核酸扩增反应。 LAMP法操作十分简单， 对仪器设备要求 低， 结果的检测也很简便快捷， 十分适合基层快速鉴别。 与传统PCR技术相比， 核。

　　12、酸恒温扩增 具有快速高效， 且不需要专用的仪器等优点。 LAMP方法因其具有高特异性、 高灵敏性、 简便、 快速、 低成本等特点， 已在病原体检测和疾病的快速基因诊断等诸多领域应用， 取得了可喜 的成就。 但目前尚未见到利用LAMP技术鉴别铁皮石斛的报道。 0025 一方面， 本发明提供了检测铁皮石斛的核酸组合， 其包括SEQ ID NO.1-2所示的内 引物组和SEQ ID NO.3-4所示的外引物组。 0026 SEQ ID NO.1-2所示的内引物组包括： 正向内引物和反向内引物； 0027 其 中 ，正 向 内 引 物 ( 3 - T P - F I P ) 碱 基 序 列 为 ：5 。

　　14、)； 0030 反向外引物(3-TP-B3)碱基序列为： 5 -CCCCTTATTGTTGGCAACCA-3 (SEQ ID NO.4)。 0031 本发明提供的核酸组合通过生物信息学分析铁皮石斛及同属近缘植物的序列差 异， 基于铁皮石斛ITS序列(GenBank登录号： HQ114245.1)， 应用LAMP在线设计软件进行引物 设计与筛选得到。 0032 同时， 为了增强该核酸组合的特异性， 本发明的发明人选择错配位点集中在B1C区 5 端的一套引物(扩增起始位点)， 并在反向内引物(3-TP-BIP)的B1C区的5 端倒数第二个 碱基(如下划线部分所示)处人为引入错配将C改为A， 使得该。

　　15、B1C区的5 端与其他种石斛对 应位置有5个以上碱基的差异， 以增加引物特异性。 以增加该引物的特异性， 实现该核酸组 合对目的片段的特异性扩增效果。 0033 采用本发明提供的核酸组合， 通过LAMP技术， 可快速、 特异、 灵敏、 简便的检测出铁 皮石斛。 0034 另一方面， 本发明提供了上述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。 0035 另一方面， 本发明提供了上述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的 应用。 0036 另一方面， 本发明提供了一种检测铁皮石斛的试剂盒， 其包括上述的核酸组合。 0037 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 该试剂盒还包括： 用于等温扩增反应的。

　　16、缓 冲液、 dNTPs、 mg2+、 链置换DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光染料中的任意一种或 至少二种的组合。 0038 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 上述荧光染料为SYBR Green I。 0039 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 链置换DNA聚合酶为Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶。 0040 还有一方面， 本发明提供了一种检测铁皮石斛的方法， 其包括： 采用上述的核酸组 合对待测样品进行LAMP反应。 0041 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 该LAMP反应的反应体系包括： 上述核酸组 合、 用于等温扩增反应的缓冲液、 dNTPs。

　　17、、 mg2+、 DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光 染料。 0042 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 上述荧光染料为SYBR Green I。 0043 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 在反应体系中， 核酸组合的外引物组与内 引物组的摩尔比为(7.8-8.2):1。 0044 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 在反应体系中， 核酸组合的外引物组与内 引物组的摩尔比为8:1。 0045 优选地， 在本发明的一些实施方案中， 25 L LAMP反应体系包括： 10Isothermal Amplification Buffer 2.5 L、 dNTPs(10mM e。

　　19、活2-3min。 0047 优选地， 在本发明的一些实施方案中， LAMP反应的条件为： 65恒温孵育40min； 95 灭活2min。 0048 LAMP反应结束后瞬时离心混匀， 在自然光下观察被检样品LAMP反应产物的颜色， 如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测样品存在铁皮石斛， 如果依然为浅黄色则表示检测样 品不存在铁皮石斛。 0049 本发明所提供的检测铁皮石斛的方法具有以下优点： (1)检测时间短， 仅40分钟即 可获得检测结果， 比现有的分子生物学检测方法缩短2-3小时。 (2)对仪器设备要求低， 不需 要普通PCR所用的PCR仪、 电泳槽及凝胶成像系统， 只要一个水浴锅即可完成检测反。

　　20、应， 可实 现现场检测。 (3)操作简单， 整个过程不涉及复杂的仪器设备， 检测结果清晰， 只用肉眼在日 光下观察观察颜色即可判断。 0050 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。 0051 实施例1 0052 本实施例提供的检测铁皮石斛的核酸组合， 其包括SEQ ID NO.1-2所示的内引物 组和SEQ ID NO.3-4所示的外引物组。 0053 其中， SEQ ID NO.1-2所示的内引物组包括： 正向内引物和反向内引物； 0054 其 中 ，正 向 内 引 物 ( 3 - T P - F I P ) 碱 基 序 列 为 ：5 - TGGGAGATTAGGCACGG。

　　26、。 0069 2.3产物鉴定： LAMP反应结束后瞬时离心混匀， 在自然光下观察被检样品LAMP反应 产物的颜色。 0070 如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测样品存在铁皮石斛， 如果是依然为浅黄色则 表示检测样品不存在铁皮石斛。 0071 实施例3 0072 采用实施例2提供的检测方法对不同品种的石斛进行鉴定， 以水作为阴性对照， 不 同品种的石斛的信息见表1， 检测结果如图1所示(图中： 1： 铁皮石斛、 2： 流苏石斛、 3： 金钗石 斛、 4： 鼓槌石斛、 5： 叉唇石斛、 6： 反瓣石斛、 7： 红头金石斛、 N： 阴性对照)。 0073 表1 0074 No.物种拉丁名采集地 1铁皮。

　　31、 2： 流苏石斛、 3： 金钗石斛、 4： 鼓槌石斛、 5： 叉唇 石斛、 6： 反瓣石斛、 7： 红头金石斛、 8： 空白对照)。 0089 根据图2的结果显示， 对照组中铁皮石斛、 流苏石斛、 金钗石斛以及鼓槌石斛具有 较强的荧光信号， 而实验组中仅有铁皮石斛具有较强的荧光信号， 由此说明， 针对ITS序列 特定位点设计的特异性引物， 并通过在反向内引物(3-TP-BIP)的B1C区的5 端的倒数第二 个碱基处引入错配碱基即将C改为A， 有效地增加了本发明提供的核酸组合的特异性。 0090 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以。

　　1.一种检测铁皮石斛的核酸组合，其特征在于，其包括SEQIDNO.1-2所示的内引物组和SEQIDNO.3-4所示的外引物组。 2.权利要求1所述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。 3.权利要求1所述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。 4.一种检测铁皮石斛的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的核酸组合。 5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于等温扩增反应的缓冲液、dNTPs、mg、链置换DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光染料中的任意一种或至少二种的组合。 6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SYBRGreenI。 7.一种检测铁皮石斛的方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1所述的核酸组合对待测样品进行LAMP反应。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LAMP反应的反应体系包括：所述核酸组合、用于等温扩增反应的缓冲液、dNTPs、mg、DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光染料。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述反应体系中，所述核酸组合的外引物组与内引物组的摩尔比为(7.8-8.2):1。 10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述LAMP反应的条件为：60-66℃恒温孵育35-45min；94-96℃灭活2-3min。

　　铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属兰科石斛属，俗称铁皮兰、黑节草，是我国传统名贵中药。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床中被广泛应用。铁皮石斛是中国药典记录加工枫斗的唯一来源，是石斛类药材中一个较为著名的商品，常被视为价格昂贵的极品。在《中华人民共和国药典》2015年版中更是被单独分列出来。但目前市场上流通的商品铁皮石斛中混杂较多，民间用于枫斗加工的材料也是五花八门。市场上有30余种石斛属及部分石仙桃属、金石斛属和石豆兰属植物在市场上冒充铁皮石斛和其它药用石斛。对于石斛干品而言，加工后的干品外形非常相似，依靠经典的鉴定方法则更难鉴别。此外，来源不同的铁皮石斛在化学成分上也有较大差异，严重影响了商品铁皮石斛质量的稳定性。

　　以环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术为代表的核酸等温扩增技术的问世，解决了核酸分子标记鉴别方法上的诸多难题，使其作为快速鉴定成为可能。LAMP是一种快速的核酸扩增技术，利用特异引物及链置换DNA聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟，就可完成核酸扩增反应。LAMP法操作十分简单，对仪器设备要求低，结果的检测也很简便快捷，十分适合基层快速鉴别。与传统PCR技术相比，核酸恒温扩增具有快速高效，且不需要专用的仪器等优点。LAMP方法因其具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等特点，已在病原体检测和疾病的快速基因诊断等诸多领域应用，取得了可喜的成就。但目前尚未见到利用LAMP技术鉴别铁皮石斛的报道。

　　反向内引物(3-TP-BIP)碱基序列为：5’-AATAAGGCTCGGATGTGCATGGAGATGACCCGCCCTTCAG-3’(SEQ ID NO.2)。为了增强该核酸组合的特异性，本发明的发明人在3-TP-BIP的B1C区的5’端倒数第二个碱基(如下划线部分所示)处引入错配将C改为A，使得3-TP-BIP的B1C区与其他种石斛对应位置有5个以上碱基的差异，以增加该引物的特异性，以实现该核酸组合对目的片段的特异性扩增效果。